Понимание уравнения метода Брэ́дфорда́ для определения концентрации белка: всеобъемлющее руководство
Формула: Cbradford = (A595 - Ablank) / k
Понимание уравнения анализа белка по Брэдфорду
Анализ белка по Брэдфорду — это быстрая и точная спектроскопическая аналитическая процедура, используемая для измерения концентрации белка в растворе. Вот разбивка:
Cbradford
— концентрация белка (мг/мл).A595
— показание поглощения образца при 595 нм.Ablank
— показание поглощения холостого раствора (без белка).k
— наклон, полученный из стандартной кривой (мг/(мл * поглощение)).
Использование параметров: примеры и интерпретации
Представьте, что у вас есть раствор образца, и вы поместили его в спектрофотометр. Поглощение при 595 нм было зарегистрировано на уровне 0,5, а для холостого раствора оно составило 0,1. Наклон стандартной кривой BSA (k) составляет 0,2 мг/мл на единицу поглощения. Подставив это в наше уравнение, концентрация белка Cbradford
будет рассчитана следующим образом:
Cbradford = (0,5 - 0,1) / 0,2 = 2 мг/мл
Выход:
Cbradford
= концентрация белка в мг/мл
Линейный диапазон и точность
Помните, что анализ Брэдфорда имеет известный линейный диапазон (обычно от 1 до 100 мкг/мл белка). За пределами этого диапазона точность снижается, и результаты могут быть непоследовательными. Это означает, что наклон k следует точно определять в контролируемой установке с использованием стандартного белка, такого как бычий сывороточный альбумин (БСА).
Проверка данных и экспериментальные условия
Для получения точных результатов важно, чтобы все значения находились в соответствующих диапазонах. Отклонения, такие как использование длины волны, отличной от 595 нм, могут значительно исказить результаты.
- Измерьте
A595
- Спектрофотометр должен быть обнулен перед вставкой образцов. - Обеспечите правильную подготовку - Разбавьте образцы по мере необходимости, чтобы поместить их в диапазон измерения.
Часто задаваемые вопросы (FAQ)
- В: Что может повлиять на показания анализа Брэдфорда?
О: Моющие средства и высокие уровни восстановителей могут повлиять на анализ. Для точных измерений следует включить надлежащие элементы управления. - В: Можно ли повторно использовать стандартную кривую?
О: Для надежности создавайте новую стандартную кривую каждый раз при выполнении анализа.
Резюме
Уравнение анализа белка Брэдфорда является бесценным инструментом в биохимии для определения концентрации белка в растворе. К критическим факторам, которые следует учитывать, относятся точное создание стандартной кривой и правильные измерения поглощения.